您所在的位置:首页 > 技术项目 > 线粒体全长测序
蛋白晶体结构解析

服务内容:

目前,解析蛋白三维结构常见的方法有X射线蛋白晶体衍射技术、核磁共振技术和低温冷冻电镜技术。X射线蛋白晶体衍射技术是利用X射线在晶体物质中的衍射效应进行物质结构分析的技术 。它的优点是分辨率高,可达到原子级分辨率。X射线蛋白晶体衍射技术既可研究水溶性蛋白,也可研究膜蛋白和大分子组装体与复合体。它能解析生物大分子的分子结构和构型, 确定活性中心的位置和结构, 从原子水平阐明蛋白质识别和结合配体分子、催化、折叠和进化等生命基本过程的分子机制, 进而有助于我们研究生命现象 。

技术简介


目前,解析蛋白三维结构常见的方法有X射线蛋白晶体衍射技术、核磁共振技术和低温冷冻电镜技术。X射线蛋白晶体衍射技术是利用X射线在晶体物质中的衍射效应进行物质结构分析的技术 。它的优点是分辨率高,可达到原子级分辨率。X射线蛋白晶体衍射技术既可研究水溶性蛋白,也可研究膜蛋白和大分子组装体与复合体。它能解析生物大分子的分子结构和构型, 确定活性中心的位置和结构, 从原子水平阐明蛋白质识别和结合配体分子、催化、折叠和进化等生命基本过程的分子机制, 进而有助于我们研究生命现象 。

 

技术原理


晶体X射线衍射是X射线在晶体中发生的衍射现象。晶体X射线衍射是X射线通过晶体时产生强度随方向而变的散射效应,其强度变化是由于次生电磁波互相叠加和干涉而造成的。 X射线衍射分析是利用晶体形成的X射线衍射,对物质进行内部原子在空间分布状况的结构分析方法。将具有一定波长的X射线照射到结晶性物质上时,X射线因在结晶内遇到规则排列的原子或离子而发生散射,散射的X射线在某些方向上相位得到加强,从而显示与结晶结构相对应的特有的衍射现象。衍射X射线满足布拉格(W.L.Bragg)方程:2dsinθ=nλ式中:λ是X射线的波长;θ是衍射角;d是结晶面间隔;n是整数。波长λ可用已知的X射线衍射角测定,进而求得面间隔,即结晶内原子或离子的规则排列状态。将求出的衍射X射线强度和面间隔与已知的表对照,即可确定结晶的物质结构。

 

服务内容


本公司提供的蛋白晶体结构解析服务步骤如下:

1.目的基因原核表达载体构建

抽提基因表达时期的RNA并反转录成cDNA,扩增得到目的基因片段,将其克隆到合适的表达载体载体上,菌液PCR验证和DNA测序验证。这一步可由您自己完成。

2.蛋白表达与纯化

重组质粒转化大肠杆菌表达菌株,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE分析蛋白表达情况以及可溶性鉴定; 表达的重组蛋白经过亲和层析(Ni-NTA affinity chromatography,NAC)、离子交换层析(ion exchange chromatography, IEC)和凝胶排阻层析(gel- filtration chromatography, GFC)纯化等蛋白纯化方法纯化,SDS-PAGE检测蛋白纯度。

3.蛋白晶体筛选与优化

利用蛋白质结晶试剂盒,借助蛋白晶体筛选机械手大规模筛选蛋白晶体生长条件,使用控制单一变量法人工优化晶体,提高晶体衍射分辨率;  

4.蛋白晶体x-射线衍射与数据收集

蛋白晶体在进行数据收集时,保证探测器与晶体距离适当,晶体放置角度合适,光线强度即曝光时间合适,才能保证获得全面的衍射信息和较高的分辨率。

5.结构解析

X-射线衍射图样的强度分布是晶体中每个原子的电子密度对X-射线的衍射叠加,由每个原子的坐标信息决定。衍射数据反映的是电子密度进行傅里叶变换的结果,用结构因子表示。通过对结构因子进行傅里叶变换,就能获得晶体中电子密度的分布。相位确定是X射线晶体结构分析的核心。

 

基本实验过程

原核表达载体构建→蛋白表达与纯化→蛋白晶体初筛与优化→晶体X-射线衍射与数据收集→相位解析→结构模型建立与结构精修

 

您需要提供以下材料

实验样品:

1 待表达蛋白的基因序列以及待表达蛋白的基本信息。
2 已构建的蛋白表达质粒

3蛋白表达纯化方法

4已纯化的蛋白溶液

实验数据和参考文献:这将会帮助我们更好地理解您的实验背景,有利于实验的顺利进行。

 

您将获得以下结果

实验结果:蛋白晶体照片的照片;蛋白晶体结构及相关参数

实验产物:引物和质粒、菌液、蛋白。

登记表格下载
相关推荐