技术简介

pUC18是一种由pBR322改造而来的质粒载体，全长2686bp。在质粒的多克隆位点（MCS)上下游含有M13正向和反向引物结合位点，以便于对插入的DNA片段进行常规测序。本方法采取同源重组的策略代替传统的TA克隆，实现对任何PCR片段的快速克隆。

质粒图谱

克隆位点

PCR产物插入位点（SalI/XbaI）：

构建流程

一、注册登录

1. 登录SMART载体快速构建系统地址：http://49.234.53.21/login（仅PC端使用）；

2. 点击登录框新用户注册，填写红色*必填项，点击注册即完成注册。

二、订单预填

1. 进入“我的订单”，点击右侧的“新增”按钮，进入新增订单界面。在此界面可以查询所有快构载体信息、订单预填或者提交订单。

2. 在“载体名称”处选择目标载体（支持模糊查询：随着输入字符的增加，缩小待选范围）。

3. 下拉框选择填入“CAB04-pUC18-PCR产物快速克隆”，然后在“上游位点”选择填入SalI位点，在“下游位点”选择填入XbaI位点。

4. 在“样品名称”里输入5个字符（为了避免和其他客户样品混淆，字母和数字组合使用），并将此名称命名在寄送的已纯化的PCR产物管子上。

5. 在“插入片段”里填入预估的插入片段DNA碱基数。

6. “是否已经纯化”：是：强烈建议提供已经电泳切胶纯化后的、不低于20ul的含指定同源臂的PCR产物（未纯化的样品在运输和后续操作过程中有可能出现降解等意外情况）。否：提供含同源臂的PCR原液100ul或电泳切胶后含单一目标条带的胶块，另收10元/样的纯化费。

7. “阳性克隆数”：客户提交订单时可以填写一次性测序多少个阳性克隆，转导生物也会根据实际提供的阳性克隆数进行更改。

8. “插入片段序列”： 在转导测序的订单需要粘贴待插入的整个目标序列（连同预计的同源臂及两端额外5-10个碱基），用于测序结果分析比对；在第三方测序的，可以不粘贴序列，随便输入一个字符代替。

9. 点击右下方的“保存”按钮。此订单的相应数据将作为草稿保存。如果后续需要修改此订单，可以点击“编辑”进行更改。

三、准备待待克隆的PCR片段

A. 分别在用于扩增的正反引物的5’端直接加上同源臂序列(直接复制粘贴无需反向互补)：5'TTGCATGCCTGCAGGTCGAC和5'GTACCCGGGGATCCTCTAGA。

    如下：ABC01F: TTGCATGCCTGCAGGTCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNNN

             ABC01R: GTACCCGGGGATCCTCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNN

             N代表用于特异扩增的特异引物序列。

A. 尽量使用优质的高保真酶扩增目标片段（为了减小碱基突变概率，尽量不用含有Taq酶的PCR酶）。（客户自主完成）；

B. 琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并切胶目标条带后纯化回收。如果条带比较弱，建议多做几个体系的PCR产物，纯化回收时用少量水反复过柱浓缩。

C. 已经纯化好的PCR样品准备好后，通知收样员收样。

D. 在“我的订单”向右横向拖拉直至看到“代理/收样员”。直接电话联系收样员（没有收样员的地区请低温快递至指定地址，拒绝到付件）。

四、克隆及测序

1. 样品送出后，在“我的订单”页面找到相应订单，点击目标订单最右侧的“编辑”按钮，提交处于保存状态的订单。（注意：A.如果是新客户，客户信息在还没有通过审核的情况下，订单提交功能还没有开通，请及时联系转导生物工作人员；B.一旦提交订单，客户将不能修改此订单，如果需要修改调整，请通过官方QQ4000275066联系工作人员）。

2. 转导生物在收到样品的2个工作日内完成克隆构建实验，并进入下游的测序环节。

3. 在转导测序的订单：提供阳性克隆甘油菌一份+小提保种质粒一份，收基础构建费用+40元/测序反应+特异测序引物合成费用（5毛/碱基）；转导生物还负责测序数据的整理、比对和结果展示。

4. 指定第三方公司（武汉奥科鼎盛）测序的订单：仅提供阳性克隆甘油菌一份，收基础构建费用+10元/测序反应+特异测序引物合成费用（5毛/碱基）；构建成功后，直接交由第三方测序公司完成1个通用引物测序，并发送至客户邮箱，客户审视结果后，如需加测请客户自行邮件沟通；根据实测反应数（10元/反应）和加测引物碱基数（0.5元/bp），转导直接收取相应费用，客户不需要向第三方测序公司支付。

五、结算和交付

1. 测序完成后，客户审视实验结果。确定无误后，转导生物根据实际测序反应数和加测引物碱基数（通过订单详情页可查看），再次核算结算金额并核销收取相应费用。

2. 结算完成，请通过官方QQ400027506通知交付相应的阳性克隆甘油菌1ml（转导测序的订单还另含对应的一份小提质粒）。